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病理免疫组化质量控制过程中应注意的几点
        免疫组化技术在辅助病理诊断和鉴别诊断过程中经常起决定性作用,同时,对肿瘤患者个体化治疗及预后评估也起到了重要的指导性作用。本文就人工免疫组化染色技巧及可能出现的质量问题进行一些总结。
 
1.免疫组化过程及注意事项

1.1 组织固定
        目的是为了保存良好的组织形态及结构,防止组织自溶。所以标本离体后30min内应剖开固定或低温保存,固定时间以8~24h为宜,4%中性甲醛渗透力强,固定均匀,抗原保存好,为首选固定液。

1.2 玻片选择
        对大多数病理科而言,一般多使用多聚赖氨酸的挂胶片,适用范围广,价格便宜;但有条件的科室可以选择阳离子免疫组化玻片,效果更佳。

1.3 组织切片
        石蜡组织切片要薄,厚度一般为3~4μm,无缺损、皱纹、折叠、气泡,烤片温度65~68℃,脱蜡要净。烤片忌高温或重复烘烤,以防止抗原扩散及丢失。

1.4 抗原修复
        直接影响免疫组化检测结果的可靠性。在进行免疫组化染色时并非所有的抗原都要进行抗原修复,抗原性保存良好或基本保存者不需要修复。不同抗体必须选择最适合的修复方法,最常用的是热修复法,尤其是细胞核抗原经热修复后,染色效果特别好。热修复包括水煮加热、高压加热和微波加热3种。
 
热修复法影响抗原修复的关键因素有2个:
 
①温度:高压加热时间为2~3min,水煮加热时间为25~30min;
 
②修复液的种类和pH值:应与修复方法和修复时间相对应。所以必须严格按照抗体使用说明书进行抗原修复。鉴于抗原修复的方法较多,在实际工作中,究竟选用何种抗原修复,应根据抗体种类予以选择,要清楚影响抗原的因素及各种抗原修复的方法,必要时可以多种方法同时使用,这样更具有针对性,标记结果更理想。虽然有学者认为,修复液沸腾时的气泡容易导致脱片,但组织处理不佳是最重要的影响因素。

1.5 抗体的选择及使用
        要选择适宜的一抗,不同的二抗与一抗浓度不匹配,都不能得到满意的结果。在滴加一抗、二抗时要先轻轻倾去PBS液,选用韧性好、吸水性强的纸巾吸干组织周围液体,轻压组织面吸干组织表面水分(不能滑动),防止试剂被稀释或致浓度不均,立即滴加适量试剂,用细玻棒将试剂扩展至组织外1~2mm,防止出现边缘效应,不能触碰组织,液面厚约1mm为宜。试剂表面的气泡用玻棒点破,否则气泡张力作用会导致局部无试剂,出现气泡下假阴性反应。湿盒孵育要定恒温,整个过程均要防止干片,孵育时必须加盖。

1.6 显色及复染
        DAB显色剂须现配现用,10min内用完。显色时间也不同程度影响免疫组化的质量,最好镜下控制显色,一般把握在3~5min,所以操作者应具备常用抗体定位的知识。显色后用苏木精复染,注意要淡染。

2.容易被忽视的问题

2.1 试剂的保存
        因为抗体是蛋白质,保存或使用不当不但会造成浪费,而且变质会出现假阴性结果。要注意抗体的有效期,对于一次用不完的抗体可保存在冰箱内,而不要放在冷冻室,反复冻融,抗体效价会急剧下降而失效。同时防止抗体的相互交叉污染和细菌污染。

2.2 环境温度
        标准实验室温度是18~22℃,实际工作中却不然,条件差的实验室冬天可低于12℃,夏天可高于37℃,冬夏温差可达到25℃。一切酶促反应温度最关键,反应程度也是冬夏季有别,这也是造成染色结果不稳定的一个重要原因,因此应该选用37℃恒温箱进行孵育。

2.3 异常染色结果及原因
①脱片:黏胶玻片不合格、组织固定脱水透明不充分、切片太厚、实验中干片等;
 
②花斑状着色:脱蜡不净、切片厚薄不匀、切片时组织下有气泡或组织不规则松脱、试剂加样时有气泡或组织表面残留水分太多、干片等;
 
③边缘效应:指组织切缘非正常着色。因一抗二抗加量少,试剂没有扩展至组织外或没有在封闭湿盒中孵育,水分挥发使边缘抗体浓度增大、组织边缘松脱或干片;
 
④非特异性背景着色:染色过程中干片或冲洗不彻底;血清蛋白密封不充分;内源性过氧化物酶未完全阻断;内源性生物素未阻断(肝、肾、胰腺,含有中性粒细胞组织);固定不及时或固定不佳;切片太厚;缓冲液酸碱度未达标。

         综上所述,人工免疫组化染色操作简单,但人为及环境影响因素较多,必须有高度的责任心和娴熟的操作技术,严格按操作流程操作,完善室内环境监控,尽可能的减少或杜绝人为和环境的干扰,才能取得满意的结果。
 
作者:马喆,王洪岩,袁东辉,威昊,张传山(天津市第三中心医院病理科、天津市人工细胞重点实验室)
来源:诊断病理学杂志
 

 

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